Il sistema di editing genomico CRISPR potrebbe essere d’aiuto per analisi e diagnosi per i pazienti più sensibili alle infezioni post-trapianto
Nel trapianto di organi, le infezioni e il rigetto sono i rischi principali. Per diagnosticarli in tempi brevi e migliorare i risultati a lungo termine sono necessarie strategie innovative, efficienti, veloci e poco costose. CRISPR può rilevare DNA e RNA in diverse tipologie di campione con un’ottima sensibilità e specificità, rendendolo uno dei test possibili al “Point Of Care” (POC), cioè utilizzabile “presso il punto di assistenza” (ad esempio direttamente a casa del paziente). In questo caso è stata sperimentata la tecnica SHERLOCK, basata su Crispr-Cas13a, per la diagnosi precoce di infezioni e rigetto in pazienti che erano stati sottoposti a trapianto renale.
Come descritto nello studio pubblicato il 13 aprile su Nature Biomedical Engineering, dal primo successo di trapianto di rene – avvenuto nel 1954 – sono stati ottenuti miglioramenti sostanziali nei risultati a breve termine nei trapianti d’organo. Purtroppo, i risultati a lungo termine non sono altrettanto buoni, con più della metà degli organi trapiantati persi dopo dieci anni. Le cause principali sono proprio le infezioni e il rigetto. La diagnostica attualmente disponibile è complessa, costosa e lenta: le analisi di laboratorio possono richiedere diversi giorni e l’individuazione del rigetto richiede biopsie invasive. Per il benessere del paziente è fondamentale un equilibrio tra terapia e monitoraggio, tempistiche ridotte potrebbero portare a un’azione precoce e limitare i danni all’organismo e al rene trapiantato.
Nello studio, sono state prese di mira l’infezione da citomegalovirus (CMV) e il poliomavirus BK (BKV), due virus opportunistici comuni che colpiscono spesso le persone che hanno subito un trapianto di rene e altri pazienti immunocompromessi. I sintomi sono variabili, spesso assenti e rilevabili solo con analisi specifiche e in fase avanzata e con la biopsia, un processo molto invasivo e non sempre preciso. Il team di ricerca, composto da ricercatori di diverse università e istituti di ricerca statunitensi e dell’Università di Medicina Charité di Berlino, ha inoltre inserito tra i suoi obiettivi anche CXCL9 mRNA, un biomarcatore la cui concentrazione aumenta in caso di rigetto.
Una versione modificata e ottimizzata della piattaforma SHERLOCK, specifica per il rilevamento del BKV e del CMV in campioni di urine e sangue, ha dato buoni risultati e potrebbe permettere, grazie al costo inferiore, di effettuare analisi più frequenti e consentire una diagnosi e un trattamento tempestivi. Come già descritto in precedenza, SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) è una piattaforma basata sul sistema di editing CRISPR in grado di identificare virus e batteri patogeni. L’enzima Cas13a ha come bersaglio l’RNA e può, in linea teorica, essere utilizzato per rilevare una qualsiasi sequenza. Sebbene sia preciso, Cas13a, una volta tagliata la sequenza bersaglio, inizia a fare a pezzetti l’RNA. Questo può essere un problema per l’editing genomico utilizzato come strategia terapeutica, ma va invece benissimo per la diagnostica poiché si utilizza un sistema con molecole fluorescenti che diventano rilevabili in seguito al taglio del RNA effettuato dall’enzima. I risultati appaiono come quelli di un semplice test di gravidanza: infatti, la “striscia di carta” viene messa nel campione e, a seconda di quello che compare, si ha il risultato (una riga = assenza del virus, due righe = presenza del virus).
Il test per il BKV è stato fatto su 31 campioni di urine e 36 di plasma e ha dimostrato il 100% di sensibilità e specificità. Per quanto riguarda il biomarcatore a mRNA per il rilevamento del rigetto, il test è stato fatto sulle urine di 14 pazienti che stavano andando incontro al rigetto e su 17 persone di controllo. Analogamente, il test ha permesso di rilevare campioni di plasma positivi al CMV con elevata sensibilità e specificità. La rilevazione del CXCL9 mRNA con il test ELISA (un test di analisi immunologica standard) ha mostrato una sensibilità inferiore ma una maggiore specificità rispetto a CRISPR. I vantaggi di SHERLOCK sono il suo costo, l’alta sensibilità e l’utilizzo di campioni di urina al posto del sangue. Oltre ad aver rilevato correttamente il rigetto, il test è stato molto accurato anche con bassi livelli di infezione da BKV e CMV.
I test POC sono molto promettenti per la medicina dei trapianti, poiché una diagnostica rapida e a basso costo potrebbe far prendere decisioni precoci sul trattamento e ampliare l’accessibilità, riducendo così il rischio di lesioni irreversibili. Per ridurre i casi di dati falsati legati alla lettura dei risultati, il gruppo ha sviluppato una app per smartphone in grado di quantificare l’intensità del colore della banda grazie all’utilizzo della fotocamera e confermare il risultato. Il tempo totale di risposta, dalla raccolta del campione all’analisi, è inferiore a due ore. È stata fatta una domanda di brevetto per questa tecnologia, ma i ricercatori hanno l’intenzione di migliorare e semplificare ulteriormente i passaggi prima di renderla disponibile tra i test POC. In futuro, la piattaforma SHERLOCK, se modificata in modo opportuno, potrebbe essere applicata ad altre infezioni e ad altri trapianti d’organo, migliorando così la gestione dei pazienti post trapianto.